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药品研发“一站式”服务包括：新药立项研究和活性筛选、药学研究(含中试生产)、药理毒理研究、临床用药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据管理和统计分析、上市后再评价、技术成果转化等，同时提供药品向美国、欧盟注册申报服务。

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袁来如此｜大分子生物分析概论（八_下）：LBA方法质量控制样品的制备和认证

作者： 时间：2021-06-10 来源：

上周，“袁来如此”专栏初步介绍了LBA中的质量控制样品（QC，quality control）制备、认证（qualification）和批次一致性维护的相关概念和实践方法。本期将延续上期内容，重点就监管机构对QC的要求、跟踪QC的效能趋势、防止分析漂移等方面做了详细解读。

“袁来如此”专栏系广州W66国际医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为W66国际医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。

监管机构对于QC的态度

LBA测试中的QC样品，应通过在合格（qualified）的基质中加入已知浓度的参考（比）标准品（用于PK定量分析），或稀释/浓缩的含有阳性对照抗体的原液（用于ADA测试）来制备。关于QC样品的组成、目标值和接受标准的通用指南，已由下述监管机构发布：美国FDA，欧洲药监局(EMA)，日本卫生部，劳动和福利(MHLW)和巴西卫生监察局(ANVISA)。表3总结了监管机构对于定量（PK）分析中所使用的QCs的制备和组成的要求。

表3.监管机构对用于定量分析QC的要求之比较。

& 应按照确立的方法制备QCs。

& 对于LBA定量方法，如PK分析，最少需要QC低、中、高三个浓度水平。高浓度QC的浓度大约是定量上限（ULOQ）的75%，中浓度QC的点相当于定量范围的几何中心（geometric center，定量下限和定量上限的中心点），低浓度QC是定量下限（LLOQ）的三倍或更低的浓度。QC浓度点应该包含在高浓度及低浓度校准点（calibrators）之间，否则即使满足%CV和%RE也不能接受。

&对于LBA定性分析，如ADA测试，需要高浓度和低浓度阳性对照（HPC和LPC）；中浓度的QC通常包含在研究前验证中，但在真实样本分析过程中是可以不用的。相关指南文件中没有提供关于HPC外加浓度的具体要求。对于LPC的指导建议是，在所制备QC的浓度水平中，有大致1%的失败率。这意味着每100个LPC中有1个预计会落在筛选微孔板的切点之外。

& 所有QC应当按照研究样本的预期存储条件和已验证的分析测试方法，以一次性使用的分装方式保存备用。

不属于监管机构要求，但同样是良好做法的其它建议包括:

& 制备足够数量的QC样品，以支持方法验证、短期和长期稳定性研究以及至少一项生物样本分析研究。

& 可以制备大量的QC，以达到可使用数年的数量。如果已经进行了或正在进行的研究（能在报告研究样本的分析结果之前提供相关稳定性数据）表明稳定性评价覆盖了整个存储窗口期。

跟踪QC的效能趋势

2011年，美国FDA发布的《生产过程验证指南》介绍了制药过程生命周期管理的概念并建议：一旦建立和验证了每个过程的性能规范（performance specifications），就要对这些过程的质量进行监控。Sondag和Schofield建议也将检测/分析方法纳入生命周期管理，分析实验室负责制定分析趋势的内部指南。

这些指导方针应预先确立，以防止研究过程中出现的问题。在理想情况下，趋势研究应在研究前验证时开始或者不迟于第一次生物样本分析。

2018年FDA的生物分析指南已经解决了对QC样品性能的监控以及对任何漂移潜在原因的评估。尽管FDA没有提供如何进行监测的准则，但值得注意的是，FDA提供了用于CLIA的趋势跟踪方法，在某种程度上该方法也适用于LBA。因为CLIA要求多名分析人员，在多天内，多次运行不同的QC组合（QC sets）。QC趋势可以是实时的，也可以是间接的（Scherder和Giacoletti讨论了两种方法的区别），大多数SPC工具的设计目标是尽早发现QC的漂移（shifts），以便制定和实施适当的纠正措施。

统计过程控制

统计过程控制（Statistical Process Control，SPC）是一种评估QC趋势的方法论，用于确保一个系统按预期持续运行。SPC分析的两个主要目标是：(a)确认过程处于统计控制状态；(b)度量其产生符合特定规范结果的能力。

SPC推荐以下步骤:

1.使用初始QC数据（如n=30）计算平均值和标准差(SD)；

2.使用平均值和标准偏差建立质量控制界限（QC limits）；

3.建立所有其它QC规则（QC rules）；

4.使用质量控制图表和建立的质量控制规则来监控过程中的趋势。

如果一个过程或方法能够预测未来的结果，那么它就处于统计控制状态。这意味着必须理解该过程中的每一个变异性的来源。质量控制图表用于监控过程中的意外变化和漂移/位移(表现为系统性偏差)，控制图表有助于识别有害的分析测试事件，如果能够建立异常结果与方法参数改变（如不同的稀释剂批次、基质批次或分析人员）之间的相关性。QC趋势分析中的控制图的主要类型包括QC的运行趋势图（run charts），Xbar-R图，组平均值的单个控制图（平均值的运行趋势图）。

运行图表是绘制每个趋势测量的最简单的图。运行图表通常与显示一种测量值与另一种测量值之间差异的移动幅度图结合。Levey-Jennings(17)是LBA最常用的运行图表(图1)。另一种常见的控制图是Xbar-R图。这种图表类型演示了每组数据的平均值及其范围的趋势。

图1. Levey-Jennings图示例。水平红线为下/上限值（lower/upper control limits，L/UCL）；虚线水平横线为观测平均值（μ0）。

这些图表的控制限制是基于检测内的可变性建立的，这使得它们不太适合LBA QC趋势分析。

图2是Xbar-R图的一个例子。此图还演示了这些图表类型是如何导致错误警报的。替代Xbar-R图表的是个体值控制图, 标绘的值是每个试验的平均值，这些是平均值运行图表。与Xbar-R图相比，平均值运行图的平均控制限度是基于试验间的变异性计算的。对于添加一个Xbar-R图表到平均值运行图上用于监控分析内变化趋势仍然是有用的。

图2. Xbar-R图的示例。Xbar图表显示了每个实验的平均值；底部是R图，表示每个分析的观察范围。对于这两张图，水平的红线是下限值和上限值; 水平黑线虚线是实验中观察到的平均值。

限于篇幅，相关图表就介绍到此，对所有细节感兴趣者请参阅文末的参考文献。

防止分析漂移

LBA的性能取决于其生物试剂组成的性能。这类分析方法严重依赖于蛋白质与蛋白质相互作用和分析试剂的结合特性，所有这些都影响分析组分对目标待测物的反应活性。随着时间的推移，这些因素使LBA容易发生校准偏移（calibration drift）。

例如，蛋白质脱酰胺化或仅由一个糖基改变的糖基化模式就可能导致偏移。校准偏移的早期迹象包括但不限于校准曲线的斜率和渐近线的变化，分析中定量上限和下限的偏移，所有这些都可能导致样本浓度计算过低或过高。最终，校准偏移导致对药物动力学的错误描述。作为补充材料的一部分，提供了LBA校准偏移的常见原因列表。

以下部分提供了预防方法偏移的评估和缓解策略。不管出于何种根本原因，以下参数均有助于识别效能偏移（performance drift）:

标准曲线

& 监测校准点浓度-响应关系，以确保校准曲线的响应值，特别是零和高浓度点的响应值，与研究前验证期间观察到的响应值相比，没有变化。这确保了LLOQ和ULOQ基本完整，其变异性（variability）与验证中所观察到的一致。

& 确保校准曲线的斜率和渐近线与方法验证期间观察到的变异性一致。

& 选择适当的替换校准品原液/参照品（reference standards），其效能特征与现有的校准品最相似。

& 确保满足先前建立的等价条件（equivalence criteria）。

& 关于校准曲线性能的其它建议，可以参考本文末DeSilva/Viswanathan/Azadeh等人的文章。

质量控制样品

& 根据之前建立的程序，交叉评估现有的和替换的QCs和/或校准曲线。加入阴性对照品和覆盖了测试范围的阳性对照品。

& 追踪合格的QCs遗留批次和替换批次的测量值之间的百分比（%）差异。

& 长期监控应包括上述遗留批次的百分比（%）差异的趋势 (或标称值，如果没有遗留批次)。

& 建议包括稀释的QC。

& 确保满足先前建立的等价条件（equivalence criteria）。

金标准样品（gold standard samples，Proficiency Panel）

金标准样品，例如美国药典（USP）或世卫组织标准（WHO）的标准品，可能只适用于临床实验室的检测，但如果可以获得时，可用于：

& 同时评估金标准样本和QC样品，有助于识别校准曲线的漂移以及替换QCs的质量认证。

& 如果金标准样品不存在,可以保留一组具有足够稳定性的研究样本，在未来替代QCs样品的质量认证中作为金标准。

虽然控制图（control charts）是有效的监测工具，但它们仅利用从各自的校准曲线得出的QC样品的检测浓度。这意味着校准曲线和QC批次都是由相同的试剂制备的。交叉评估现有和替代QCs是正确的趋势分析和防止漂移的关键方法。在这方面，保留遗留的QC批次，并将它们与新QC批次桥接起来就显得颇为重要。因此，趋势研究和漂移监测最有效的方法就是交叉评估，即根据现有和替换的校准曲线来评估任何给定的QCs的效能。

在保持可靠的趋势和检测漂移上，关键是下列问题：

1. 一个适当的、合格的混合基质：经过验证的分析方法应明确认证替换混合基质的测试设计和接受标准。

2. 适当的运行次数：有助于最大限度地降低可变性。

3. 每次运行使用足够/适当数量的QC：大多数机构指南以及大量文献都提出了相关建议。

4. 适当的位置可变性：将QC样品置于微孔板的左上和右下四分位点，或适当地放置在运行开始和结束的时候 (使用Lever-Jennings原则来监测QC的效能)。

5. 在方法开发的早期和预研究验证中引入变化性的条件：不同的分析人员、不同时间段、多个微小规模的制备工作都是为了捕获变化因素。

讨论

成功地管理LBA方法的生命周期是通过证明质量控制样品（QCs）效能的一致性而实现的。由于QCs是关键的监控工具，所以实验室必须建立相关标准程序（SOPs），以制备、认证QCs并监测其效能趋势。本文旨在提供：1.与LBA的QCs相关的指南和最佳做法，同时在生物分析界建立共识；2.提出了更换QC批次的认证方法，并提供了监测QC效能的实用方法；3.讨论了管理和应对QCs样品的各种问题，可以作为生物分析实验室的参考文献。

特别声明

本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。

扩展阅读

参考文献

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2. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. AAPS J. 2003;20(11):1885–900.

3. Viswanathan CT, et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. Pharm. Res. 2007;24(10):1962–73.

4. US Food and Drug Administration. Guidance for industry: bioanalytical method validation. Silver Spring: Center for Drug Evaluation and Research; 2018.

5. Azadeh M, et al. Calibration curves in quantitative ligand binding assays: recommendations and best practices for preparation, design, and editing of calibration curves. AAPS J. 2018;20:22.

6. Nowatzke W, Woolf E. Best practices during bioanalytical method validation for the characterization of assay reagents and the evaluation of analyte stability in assay standards, quality controls, and study samples. AAPS J. 2007;9(2):F117–E122.

7. Marcelletti JF, et al. Calculations for adjusting endogenous biomarker levels during analytical recovery assessments for ligand-biding assay bioanalytical method validation. AAPS J. 2015;17(4):939–47.

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13. Levey S, et al. The use of control charts in the clinical laboratory. Am J Clin Pathol. 1950;20(11):1059–66.

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