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袁来如此｜大分子生物分析概论（二_1）：LBA定量方法的监管验证
作者：广州W66国际医药 时间：2021-01-27 来源：广州W66国际医药

上周，“袁来如此”专栏正式开篇，W66国际医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士以《大分子生物分析概论（一）：大分子药物生物分析的基础知识》为题，梳理了大分子药物分析方法的基础概念。


本期开始，“袁来如此”专栏将就LBA定量方法的监管验证展开详细介绍，预计将有多篇重磅干货内容呈现，敬请垂注！

1.历史视角

1992年，美国弗吉尼亚州水晶城，全球首个关于生物分析方法验证会议召开，会议讨论共识的生物利用度、生物等效性和药代动力学研究的生物分析方法成为了后来制药行业进行生物分析方法验证的实际准则。史称水晶城会议。

水晶城会议还讨论了生物分析方法验证的普遍问题，同时也承认了色谱和非色谱测试方法（包括免疫测试方法和微生物方法）之间存在差异。以水晶城会议为基础，后续的行业会议和文献对生物分析方法验证进行了多次讨论。

迄今为止，人们最重视的是常规小分子药物的生物分析方法的验证，其主要原因是自从1990年以来，作为小分子药物的常规分析工具——串联式液相色谱-质谱仪（LC-MS/MS）的使用率在迅速地增长。而大分子的生物分析方法亦对此借鉴颇多。

在本文中，LBA 是免疫测试方法（immunoassays）的同义词，指任何基于大分子相互作用进行定量分析的方法；监管验证（regulatory validation）则是通过验证后方法所产生的分析数据，可供生物药物的临床前毒理研究和临床申报、注册使用。后续文章将详细解释监管验证与非监管验证之间的差异，敬请关注。

2.导论

一个分析方法的生命周期通常可分为3个阶段：方法开发（method development）、研究前验证（pre-study validation）和研究中验证（in-study validation）。方法开发是建立分析方法的过程，而研究前验证是对分析方法的确认，研究中验证则是在应用过程中，如出现关键成分发生变化后，进行的部分验证。

为了确保一个分析方法能用于大分子定量，以支持药代动力学评估，并经得起监管审核，需要对特定分析方法的各个组成部分进行评估、验证和持续监控。因此，只要使用该分析方法，其验证就是一个持续的过程。

所以，方法验证是一个动态的过程。表1总结了需要评估的组分和对于分析方法生命周期中每个阶段的建议。本文的组织也对应于这些方法组分，在相应的章节中，将讨论在不同阶段中可能开展的活动的更完整、详信的信息。

表1. 验证评估参数汇总



3.文件记录

方法开发阶段

在方法开发过程中生成的信息应记录在实验室笔记本或其他可接受的文档形式中。应包括以下评估信息：关键检测试剂的选择和稳定性、测试格式的选择（抗体、稀释液、微孔板、检测系统等）、标准曲线模型的选择、样本基质的选择、试剂的特异性、样本制备、初步的稳定性研究和方法稳健性（robustness）的初步评估。在方法开发阶段结束时，应生成方法草案或方法验证工作列表（即需要进行的实验），供研究前验证期间参考。

研究前验证阶段

在开始研究前验证的实验之前，应撰写一个方法验证计划或者是可以参考适当的标准操作程序 （SOP），以确保研究前验证所需要做的实验有一个书面大纲。此验证计划可以是一个独立的文档，也可以是实验室记录本或类似文档的一部分。
该文件应包括对此方法预期用途的描述以及需要验证的性能参数，这些参数包括但不限于标准曲线、精密度和准确性、定量范围、特异性和选择性、稳定性、稀释线性、稳健性、运行大小（批次batch/run size）和运行接受标准。该验证计划应包括拟进行的实验工作所研究的每个性能参数的目标接受标准。
完成验证实验后，应撰写一份全面的报告，报告的格式可以由实验室的内部政策决定，此报告应汇总测试性能数据、涉及方法SOP或验证计划的偏差以及任何其他相关信息。

研究中验证阶段

在实验过程中，研究人员需要生成包含适当统计参数的标准曲线和质量控制样品（QC）的累积数据汇总表，并将其与研究样本的测定数值汇总到最终的研究报告中。与研究前验证不同的是，这些表格中不包括失败的运行。最终报告中需包含的其他信息包括：分析过程中发生的偏差描述、重复分析的样本汇总及其原因以及所有未通过运行的详细信息的汇总表。
4.测试试剂的选择、稳定性、测试格式和运行/批次大小（batch/run size)
LBA分析方法的关键组成部分是配体试剂（ligand reagent），通常是用于免疫测试的一个或一对抗体。此外，其他配体试剂还可能包括结合蛋白（binding protein）、受体（receptor）、寡核苷酸（oligonucleotide）和多肽片段。为简单起见，本文仅讨论免疫测试用的试剂（必须选择拥有适当特异性和选择性试剂，其应当具有能够持久且稳定地形成抗体/抗原复合物的结合特性）。
LBA的测试格式包括但不限于：夹心式、竞争式、直接或间接结合抑制以及固相或溶液相的测试格式。
一个典型的测试运行（batch/run）包含了标准校准样品（standard calibrator）、验证样品（validation sample）、QC 样品和研究样本（study sample），在应用要验证的方法时须将它们作为整体进行分析。在理想状况下，所需最低数量的QC样品应代表给定运行中研究样本总数的5%。对于基于微孔板的测试方法，一个运行可以包括多个独立的微孔板，但每个微孔板应包含独立的一组校准样品和QC样品。

方法开发阶段

方法开发的第一步是选择测试格式。对于固相测试，必须选择固定抗体或其他蛋白质。如受体的固相，常为塑料和玻璃表面，但二者之间的差异可能很大，还会影响方法的灵敏度和变异性。如果使用主动吸附（active adsorption，例如avidin-biotin），则必须选择用于改变固相表面（包板）的合适的化学反应。被动吸附（passive adsorption）是最常用的包板方法，但会受到所使用的缓冲液特性（例如盐浓度和pH）的影响，必须适当地选择包板溶液的浓度/体积、混合蛋白质的模式（摇动与涡旋）和包板的温度。
在选择测试稀释液时，必须考虑待测物、预期的基质和结合实体（例如抗体或受体）的具体特征。例如，可能需要添加重金属或螯合剂，以便确认达到最佳的结合状态。此外，还可能需要考虑去污剂（例如，Tween-20或Triton-X100）或填充蛋白（如albumin,casein或gelatin），从而优化测试方法的性能。
实验过程中应当选择合适的信号检测系统，以提供可接受的信号并使背景噪声最小化。使用比色法（colorimetry）以外的信号检测系统，可以提高检测的灵敏度。这些检测信号系统包括荧光、化学发光、放射性测定和电化学发光。使用信号放大系统可以实现更高的灵敏度。除了分析方法的各个组分外，在方法开发过程中，还应当选择、建立和运行该分析方法的格式，如竞争式或非竞争式。
应当建立分析配置（assay configuration，例如标准品、QC样品和研究样本在微孔板上的位置），并测试与预期的研究中测试运行相同数量的微孔板。应当根据测试方法的性能与所需的测试精密度之间的关系来确定用于标准品、QC样品和研究样本的重复孔数量。虽然最终结果可以基于单孔或复孔的分析结果，但确定QC样品结果的重复孔数量必须与用于获取真实样本结果的重复孔数量相同。
对运行内（intra-batch/run）和运行间（inter-batch/run）测试性能的评估，需要为每个验证样本生成多个结果，其中每个结果都是根据重复孔的响应值计算的。测试运行的数量和每个样本的重复孔结果（即重复测量结果）的数量应足够大，从而可靠地估计该测试方法的性能特征。稍后在涉及特定性能特征（例如，精密度和准确性）的部分中，将提出有关最少测试运行/重复孔数量的建议。

研究前验证阶段

在方法验证时，应当使用在方法开发阶段识别和优化了的关键测试试剂（简称关键试剂），且不能更改，并在方法SOP中予以标识。在方法验证的过程中，将确认方法草案中定义的这些关键试剂的性能。还应当确认分析配置（如微孔板数量、标准品和验证样品的位置、重复孔数量、操作条件等）以及在方法开发过程中确定的测试运行的大小（batch/run size）。

研究中验证阶段

在测试方法的生命周期中，通常需要更换某个关键组分（例如试剂批次）。对已验证组分的更改，需要进行部分验证，来证明其具有类似的性能。此外，还可以使用在常规分析运行中QC样品产生的可接受结果，来延长关键试剂（不包括参考标准，reference standard）的有效期，并且必须根据这些数据，仔细记录有效期的延长。在研究中验证时，应当使用之前验证过的测试格式，对此格式的任何更改均应清晰地记录在案。如果进行了重大更改，则可能需要进行部分验证，以证明测试性能的可比性。
5.参照（比）物（REFERENCE MATERIAL)
用于制备标准校准品（standard calibrator）、验证样品和QC样品的物料来源会有所不同。须着重了解物料的来源及相关说明材料。在条件允许的情况下，尽可能地将标准品、验证样品、QC样品等从同一来源物料的单独分装（separate aliquot）小份中制备。参照（比）物在供应有限的情况下（例如，药物相互作用研究，其中纯标准品只能从商业试剂盒这样的有限来源获得），可以通过考查不同批次或其他商业商品之间的可比性后，从同一个单个等分（single aliquot）物料中制备标准品和QC样品。
6.特异性（specificity)和选择性（selectivity）
抗体的特异性（specificity）是指其结合目标抗原的能力。在理想的情况下，所使用的抗体对待测物是特异性的，即不与样品中可能存在的待测物的变异体，或其他结构相关的物质发生交叉反应。特异性有时与交叉反应性的概念有关，如果抗体是高度特异性的，则其交叉反应性较低。
选择性（selectivity）是一个与特异性有关的概念，是一种分析方法在样本中存在其他成分的情况下检测待测物的能力。通常，LBA无需样品预处理（例如萃取），可直接在生物基质中测定待测物的浓度，但此做法或将受到试剂与样本基质成分的交叉反应所引起的非特异性反应的影响。特异性和选择性评估将验证该分析方法是否对待测物具有特异性，并且可以从复杂的基质中选择性地定量待测物，而不被正向或负向的干扰所影响。

方法开发阶段

分析方法的特异性将取决于所使用的抗体或抗体对（antibody pair）的预先确定的特异性。抗体可以从商业来源获得或内部生产。无论哪种情况，在选择之前都必须评估抗体结合特性的数据，评估分析特异性的方法通常是分析样本基质，样品基质+不同浓度的待测物及其变异体、物理化学上类似的化合物以及样品基质+可能与待测物共同使用的化合物。

在某些情况下，可以使用一个样本基质来评估特异性，该样本基质包含与体内浓度相当的一种或多种与待测物有关的化合物。通常，竞争式测试格式比夹心式测试格式更易受干扰物的干扰，因为夹心式分析方法使用两种抗体，故具有更大的特异性。

如果无法获得待测物的变异体或相关形式，则可能无法在方法开发过程中生成交叉反应性（分析特异性assay specificity）数据。因此，可能需要对经过验证的分析方法的特异性进行回顾性评估，因为随着时间的流逝，将产生更多有关待测物行为的数据。

在方法开发过程中，评估选择性即是评估存在基质成分时对待测物的定量。这些基质成分可能会干扰抗体与待测物的结合，应当在定量下限（LLOQ，即低于低水平QC样品的浓度）或之上的附近外加待测物到同一样本基质类型的多个批次(至少10个)中，并评估相对误差的百分比（%RE）。尽管选择性问题通常在定量范围的低端发生，也需要在较高待测物浓度下评估选择性。在背景干扰与浓度有关的情况下，必须确定在哪个待测物的浓度之下可能出现干扰。在方法验证之前，可能需要相应地提升最低的定量限。

研究前验证阶段

研究前的验证过程将证实分析方法的特异性和选择性性能（使用最相关的化合物和样本基质）。选择性由回收率（recovery）代表，回收率的接受标准与准确性评估相同。推荐的选择性接受标准是：至少80％被评估的样本基质均获得可接受的回收率。

研究中验证阶段

在样本分析过程中，通常不存在针对特异性和选择性的接受标准。如果存在潜在的干扰问题，则必须事先确定样本的性能特征，并做相应的处理。通常情况下，疾病状态的样本基质可能包含对照基质中不存在的成分，例如，类风湿因子（rheumatoid factor）脱落的可溶性受体，来自自身免疫性疾病的异源干扰、高血脂（lipemic）样本、溶血（hemolyzed）样本等。因此，强烈建议在获得相关疾病状态的样本基质后，重复进行选择性和特异性实验。更换抗体批次后，也需要重新验证特异性和选择性。
7. 特别声明

本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备，欢迎读者提供有价值的文献及其评估。

8. 扩展阅读

袁来如此｜大分子生物分析概论（一）：大分子药物生物分析的基础知识

参 考 文 献

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2. J. W. A. Findlay, et al. Validation of Immunoassays for bioanalysis: A pharmaceutical industry perspective. J. Pharm. Biomed. Anal. 21:1249–1273 (2000).

3. C. M. Riley and T. W. Rosanke. Development of validation of analytical methods: progress in pharmaceutical and biomedical analysis (vol 3) Elsevier (Pergamon), NY 1996.

4. V. P. Shah, K et al. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetics studies. Conference Report. Eur J Drug Metabol Pharmacokinetics 16:249–255 (1991).

5. Guideline on validation of analytical procedures: definitions and terminology International Conference of Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use Geneva 1995 (1996).

6. V. P. Shah, et al. Bioanalytical method validation. A revisit with a decade of progress. Pharm. Res. 17:1551–1557 (2000).

7. K. J. Miller, et al. Workshop on Bioanalytical Methods Validation for Macromolecules: Summary Report. Pharm. Res. 18:1373–1383 (2001).

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12. D. Rodbard, et al. Kinetics of Two-Site Immunoradiometric (Sandwich) Assays-II. Immunochem. 15:77–82 (1978).

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14. C. Hartmann, et al. Reappraisal of hypothesis testing for method validation; Detection of systematic error by comparing the means of two methods or two laboratories. Analytical Chem. 67:4491–4499 (1995).

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